Natalie é filha única do médico israelita Avner Hershlage da dona-de-casa Shelley Stevens (sua atual agente). Quando a atriz tinha apenas quatro anos, sua família mudou-se para os Estados Unidos da América. A atriz é judia e vegetariana desde os oito anos.
Portman frequentou a Universidade de Harvard, onde formou-se em 2003 em psicologia e a Universidade Hebraica de Jerusalém, onde graduou-se em 2004. Desde os quatro anos pratica aulas de balé e sabe falar fluentemente inglês e hebraico e tem conhecimentos de francês e alemão.
